工艺制造 | 临床级间充质干细胞的技术壁垒

撰文│步步先生   来源│干细胞者说  如需转载请联系原作者

间充质干细胞（MSCs）作为一种“活的药物”，要满足临床研究的大剂量需求，除了对同一个体的MSCs进行细胞培养以外，还可以采用不同个体的MSCs，不论哪种方式都对“细胞质量”的统一性提出了挑战，如果要开发一种“现货型”同种异基因MSCs产品，异质性必然是是一道迈不过去的坎。如何去面对这个挑战，如何将MSCs产品异质性的影响降到最低，本文进行一简要介绍。

一、间充质干细胞产品的异质性

MSCs疗法虽然在某些疾病上取得了巨大成功，但其还存在一定临床局限性。临床失败的关键在于，其免疫调节和血管再生作用在临床试验中具有不可预测性，根源在于MSCs是一种活的药物，其关键质量属性（CQAs）很难界定。

MSCs产品的CQAs

MSCs产品的常规检测，除了鉴定、活性、纯度、效力、增殖能力、基因组稳定性和微生物实验等评估外，还应检测与MSCs治疗功能相关的关键质量属性（比如抑制T细胞增殖或IDO表达）。

如何评价细胞产品的CQAs，这是细胞治疗领域面临的独特挑战。传统的化学药品，其结构和效力可以严格定义，但MSCs产品不同，这是一种动态“活的药物”。

临床试验开始前，MSCs标准化产品的治疗效力至关重要。

效力（Potency）：FDA给出的定义是 “在适当实验室方法检测下或在预期方式管理条件下，通过大量临床数据获得的产品特殊能力或功能。” 通常，效力用来评价药物产生特定生理功能的浓度或数量，由强度（strength）和效果（effectiveness）两个因素组成，即相同强度（一般指浓度）下所取得的效果。

如此，开发一种针对MSCs产品效力的测定方法非常有必要，准确地将MSCs产品的CQA与它们的治疗功能相关联。目前，用于MSCs产品效力最广泛的评价方法是：淋巴细胞增殖抑制试验。与免疫调节功能的替代标志物（即IDO表达或TSG-6表达）相比，显然不如后者更能代表效力，因为后者可直接读出生物活性。

MSCs产品的异质性

MSCs是一种异质性细胞群，其基因和蛋白表达谱图与多种因素有关（诸如供体特征、组织来源、分离方法、以及体外扩增培养方式）。不同供体、不同组织来源，甚至不同的制备工艺都可能造成MSCs终产品出现异质性。

目前，在制备过程中尽量避免MSCs产品异质性的策略有两种：

生物材料：在聚乙二醇水凝胶基质上，MSCs的扩增过程可避免细胞表面标志物和细胞因子表达的降低。3D培养系统也有利于MSCs在扩增过程中维持早期传代表型。

多能干细胞：由于iPSC增殖能力更强，因此可以轻松扩增大量iPSC，然后再分化获得大量MSCs。因此，iPSC-MSCs可能是规模化生产MSCs的有效解决方案。

MSCs产品异质性的另一大挑战是冷冻保存对MSCs效力存在潜在的不利影响。研究发现，可以通“培养复苏”MSCs的方式来解决。培养复苏：即在使用解冻的MSCs前进行短暂复苏培养，从解冻到输注需要至少24小时。

二、如何增强间充质干细胞的治疗效果

如果建立MSCs产品效力的标准化质控方案，则有助于降低临床失败的风险。临床试验表明，在保证安全的前提下，MSCs的大剂量输注可保证某些临床应用的有效性。为最大限度发挥临床效力，促进MSCs的“天然属性”，且独立于冷冻保存，扩增倍数，供体和组织来源等，可通过生物工程解决方案增强MSCs的“天然属性”。

小分子预处理

小分子“预处理”，是一种增强MSCs治疗效果的简单策略。其中最著名的就是Brainstorm公司的MSCs产品NurOwn®，其专利培养基（含GDNF、HGF和VEGF等）可诱导细胞分泌高水平神经营养因子（NTF），将MSCs转化为MSC-NTF细胞，后者可以直接递送至损伤部位，分泌多种神经营养因子和免疫调控因子，触发生物学效应，最终减缓或稳定疾病进展。
在II期临床试验（NCT02017912）中，渐冻症患者在接受NurOwn®治疗24个月后，病情进展与对照组相比减缓。Brainstorm正在扩大NurOwn®的适应症范围，招募患者参加硬皮病（NCT03799718）的II期临床试验。

载药颗粒处理

小分子“预处理”虽然有用，但效果仅持续数小时到几天。因此，一种小分子封装微粒（MPs）也被用于提高MSCs产品效力。MP含有生物相容性材料，可根据其成分、分子量、载药量和药物释放速度，以调控MSCs产品的治疗作用。

与经游离的布地奈德（一种肾上腺皮质激素类药）“预处理”的MSCs相比，载有布地奈德的MP处理MSCs后，在体外显示出四倍的IDO活性增强。经IFN-γ刺激后，MSCs产品对外周血单个核细胞（PBMC）的抑制作用提高了2倍。

基因改造

除了增强其“天然属性”，另一种策略是对MSCs进行基因改造，将其改造成生物制剂“生产车间”。为了在MSCs内产生所需的生物制剂，转导和转染是最常见的方法。

Suresh等人的一项研究表明，经过基因工程改造的MSCs，通过表达一种具有抗氧化作用的蛋白，在大鼠模型中改善了心肌梗死后的心脏功能。此外，还可以将MSCs改造成携带抗肿瘤药物的载体。MSCs可避免免疫细胞追杀，利用肿瘤趋化性到达肿瘤部位，达到癌症治疗的目的。

溶瘤病毒处理

溶瘤病毒（OVs）可直接裂解肿瘤细胞，或触发抗肿瘤免疫反应，通过MSCs作为其载体，定位至肿瘤部位，释放溶瘤病毒发挥作用。如果在MSCs中装载OVs，可有效保护OVs免受机体破坏而影响其有效性，但使用MSCs作为OVs载体的一个限制是：MSCs在转导时仅表现出中等感染力。

基于OVs技术联合MSCs疗法临床试验（NCT02068794），治疗复发性卵巢癌。临床前数据显示，用OV-MSCs治疗SKOV3卵巢癌小鼠后，小鼠寿命明显长于仅用OVs治疗的小鼠。

生物工程解决方案比较

不同供体、不同组织来源，甚至不同的工艺制造都可能造成MSCs的异质性，这给临床结果稳定性制造了不小挑战，可通过生物工程解决方案（小分子预处理，载药颗粒处理、基因改造和溶瘤病毒处理），以增强MSCs的治疗效果。

如果建立MSCs产品效力的标准化质控方案，则会降低其异质性的影响，有助于降低临床治疗失败的风险，不同给药途径和患者适应证的选择也是影响MSCs临床成功的关键因素。

《医学参考报》干细胞与再生医学专刊

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